PR,ACTICA 11:ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS HEMATÍES (27/02/11)

FUNDAMENTO:
Éste estudio valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones osmóticas.Ésta prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de su contenido acuoso.En

PRÁCTICA1ºTRIMS:DETERMINACIÓN DE HEMATOCRITO.

fundamento:

es para determinar la relación existente en % entre el volumen de hematíes con respecto a la sangre total.

material:

-2 capilares

-centrifugadora de microhematocrito

-plastilina

-una regla o un lector de microhematocrito.

reactivos:

-EDTA,lo llevan los capilares heparinizados,(los de la franja roja).

muestra:

-sangre capilar o venosa con EDTA.

técnica:

-1llenamos los capilares 3/4 partes y se limpia el exterior con una gasa .

-2.sellamos con plastilina y los introducimos a centrifugar unos 5 min( en clase con la sangre de bolsa hemos centrifugado 10 min ).

-3entonces cojemos una regla milimetrada y formulamos.

resultado:

     capilar 1:                             capilar 2:

            1.7 x 100                                1.6 x 100  

HCT=    ----------= 41,46%    HCT=    ----------= 40%

                  4.1                                          4

-como la diferencia no es mayor de un 2% no la tenemos que repetir ahora se realiza la media de los dos capilares y ya obtenemos el hematocrito.

41,46 + 40=81,46/2= 40,73%

interpretación:

-nos indica un nivel bajo ,pero muy poco ya que el valor normal de mujeres esta entre 42-47%.

-puede indicar una anemia o un enganño ocasionado por hemodilución como por ejemplo en el embarazo.

hoja de trabajo:

1¿qué significa la franja roja que tienen algunos capilares de microhematocrito?

-que van heparinizados.

2.¿a qué fuerza relativa de centrífuga(g) se centrifuga la sangre?

-12000g

3si la medida de la columna de eritrocitos es de 20mm y la de la columna total es de 50,¿cuál es su valor de hematocrito?

-HCT =20 x 100 /50 =40%

4.si con un capilar se obtiene un HCT de 45 y el otro de 43,¿como debe ser la forma de actuar de los resultados?

-pues como su diferencia no es mayor de un 2%,se realiza la media y el resultado es el resultado válido del HCT.

PRÁCTICA 1ºTRIMEST:VISUALIZACIÓN CÁMARA DE RECUENTO

fundamento:
-consiste en saber la utilización de la cámara de recuento de Neubauer mejorado,para poder contar en ella el número de cualquier población celular que hay en un volumen determinado de sangre.
material:
-microscopio
-cámara de recuento con un retículo de Neubauer mejorado
-papel y lápiz.

procedimiento y hoja de trabajo:
-1.primero observamos con objetivo 4x, luego 10x, y luego con 40x.
-2enfocar con el de 10x ,uno de los cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande periférico:---------(hay 16)
-teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3mm,calcular:
-la longitud de los lados de cada cuadrado grande periférico:----1mm.
-la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos englobados en un cuadrado grande periférico:------0,25mm.
-teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0,1mm,calcula el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de :
-el retículo entero:-----0,1x3x3=0,9mm3 de sangre.
-un cuadrado grande periférico:-----0,1x1x1=0,1mm3
un cuadrado mediano incluido en un cuadrado grande periférico:----0,1x0,25x0,25=0,00625
-3.enfocar,con el objetivo de 10x el cuadrado grande central.
-contar el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande central:----25
-contar el número de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos:--16
-teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3mm,calcular:
-la longitud de los lados del cuadrado grande central:----1mm.
-la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos incluidos en el cuadrado grande central:----0,25mm.
-la longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños contenidos en uno de los cuadrados medianos:----0,05mm.
-teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0,1mm calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada,a nivel de :
-el cuadrado grande central:------0,1x1x1=0,1mm3
-un cuadrado mediano englobado en el cuadrado grande central:----------0,2x0,2x0,1=0,004mm3.
-un cuadrado pequeño incluido en uno de esos cuadrados medianos:------0,05x0,05x0,1=0,00025mm3.

PRÁCTICA 5:RECUENTO DE LEUCOCITOS

fundamento:
esta técnica nos sirve para determinar el número de leucocitos que hay en un volumen determinado de sangre.
material:
-una pipeta Thoma para recuento de glóbulos blancos.
-un tubo de goma.
-cámara de Neubauer(para glóbulos blancos)
-cubreobjetos.
-microscópio.
reactivos:
dilución Turck.
muestra:
-sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA.
técnica:
1.preparar cubre en  cámara de neubauer
2.Realizar la dilución en la pipeta thoma(el líquido diluyente asta 101 escrito en  en la pipeta thoma.
3.Homogeneizar bien suavemente dos minutos.
4.Desechar las tres primeras gotas.
5Depositar una gota de la dilución en la cámara de Neubauer, y dejarla secar unos minutos.
6.Observamos en microscopio primero con 10 x  y luego 40x                              
7.Se cuentan los observados en las 4  esquinas y se realiza la fórmula  WBC = L/4 x 10 x D=
                                                                                                                             

resultado:                                                                                                            
-en 4 cuadrados hemos contado 188 leucocitos,y realizando la fórmula:  WBC  = 188/4x10x10=4700                                                                                                                        
-hay 4700 leucocitos en 1mm3 de sangre.
interpretación:
-el WBC está por debajo de los niveles normales e indica una leucopenia.

hoja de trabajo:
1.¿que es el líquido de dilución utilizado en el WBC?
-el Turck.
2.¿para que sirve el violeta de genciana que contiene el líquido de dilución?
-tiñe el núcleo de los leucocitos para observarse mejor.
3.¿con que objetivo se pueden observar los leucocitos?
-con el objetivo de 10x.
4.¿si la sangre se diluye a 1/10 y se cuentan 100 leucocitos en 2 cuandrados grandes periféricos,¿cuál es el WBC obtenido?
-WBC=200:4X10X10=5000 leucocitos/mm3 de sangre.

PRÁCTICA Nº10: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBIA.(29-01-15)

fundamento:

Para detectar qué TIPOS  de hemoglobina  hay en sangre.

material:

-tiras de cellogel

-aplicador de electroforesis semicírclo

-rodillo

-bandeja

-cubetas de plástico

-fuente de alimentación

-placa de vidrio

-centrifugadora
-pipeta de 5ml

fotografías de material preparado por profesores:

reactivos:

-agua destilada

-suero fisiológico

-ácido acético 5%(solución decolorante)

-metanol,ciclohexanona, ac.acético glacial(solución transparentadora)

-cloroformo

-metanol

-tampón ph 8.8

-Negro amido(coloranre)

técnica:
-PRIMERA PARTE DE LA TÉCNICA

-Preparación de hemolizado:

1.Preparamos 3ml de sangre.

2.Lo centrifugamos a 3000 rpm unos 10 minutos.

3Retiramos el sobrenadante con una pipeta pasteur de cristal y le echamos 4-5 ml de suero salino.

4Homogeneizamos bien con pipeta pasteur que hemos comprobado que da mejor resultado que con un agitador magnético.

5.Lo introducimos de nuevo a la centrifugadora 5 min (en clase hemos centrifugado 10 minutos porque con 5 se quedaba el proceso sin terminar).

6.Volvemos a repetir este paso de lavado unas 3 veces consecutivas.

7.Se repite la operación pero ésta vez lo hemolizamos con cloroformo y agua destilada(medimos el volumen de hematíes y se le añade media parte de cloroformo,que lo introducimos en la cámara de seguridad y parte y media de agua destilada.


Ejemplo:si de hematíes hay un volumen de 1ml,echamos 0,5 de cloroformo y 1,5 ml de agua destilada.
 -2ª PARTE DE LA TÉCNICA:
-1 intoducimos tiras cellogel en cubeta boca arriba en tampon durante 10 min que se empapen bien.
-2 colocamos las tiras en el puente, lo introducimos en cubeta y colocamos nuestra muestra en la tira,haciendo una fina raya de sangre. Le aplicamos la fuente de alimentación a 400v durante 15 min.(porque con 10min no nos a salido bien).
-3colocamos las tiras boca abajo en:
-bandeja con negro amido 10 min(tinción)
-bandejacon ác.acético 5% 10 min(decoloración)se repite 3 veces.
                                         -bandeja con metanol 1 min(deshidratación)
                                         -bandeja con solución transparentadora 2-3 min(transparentación).
3.Después se colocan las tiras en una placa de vidrio y las alisamos con un rodillo,con la parte absorbente boca abajo.
4.Metemos en la estufa unos 60-70ºC unos 5-6 min hasta que las tiras queden transparentes del todo.

resultados:
-hemoglobina A.

PRÁCTICA 9:CÁLCULO DE ÍNDICES ERITROCITARIOS(.26/01/15)

fundamento:
-Ésta técnica consiste en tres determinaciones a los que llamamos índices eritrocitarios primarios:
-recuento RBC
-concentración de HB
-Hematocrito.
-A partir de sus resultados podemos obtener otras determinaciones a las que llamamos índices eritrocitarios secundarios:
-VCM
-HCM
-CCMH
-recuento de RBC: 

-como no teníamos la pipeta thoma para glóbulos rojos la hemos realizado mediante una regla de tres y las micropipetas.

-partiendo que 1ml------=1000microlitros.

-si 1ml-----------0,5ml

-x-----------------100ml

         x  = 100

              _____   =    0,005ml = 5microlitros (de sangre se ha de echar)

                0,5microlitros

-0,5ml -0,005ml = 0,495ml = 495 de reactivo.

-hemos diluido 5microlitros de sangre en 495microlitros de reactivo.

-al observar en microscopio:

-RBC = 460 x 5 x 10 x 100 = 2300000/mm3.

-nos ha dado un resultado muy por debajo de los índices normales ya que no lo hemos echo con sangre fresca.

Hematocrito:

-lo hemos realizado de las dos maneras:

-mediante el microhematocrito que nos ha dado 40%

-mediante una regla y la fórmula:

-primer capilar:                          2,2 x 100

                                     HCT   =  ________  =  44 %                      44 + 44,23

                                                          5                               HTO=    ___________= 44,11%

-segundo capilar:                                                                                     2

                       2,3 x 100                                        (nos ha salido un valor normal)

        HCT=   ___________= 44.23%                                             

                           5,2

Concentración de hemoglobina:

-patrón:nos a dado una absorbancia de 0,200

-muestra 1: de 0,256

-mestra 2: de 0,124

  -0,256                                                                     0,124

 ______ x 15 =19,2g/dl                                         _______ x 15 =9,3g/dl

   0,200                                                                       0,200

-la muestra nº1,ha salido un poco más alta que los valores normales en un hombre.Puede indicar una anemia.

-la muestra nº2, ha salido comprendida entre los valores normales de una mujer.

Ahora vamos a calcular los índices eritrocitarios secundarios
               hto       44,11   
 VCM= ____=______ x 10 = 191 fl ---------------------indica macrocitosis.
               rbc         2,3
              ( hb)                  9,3
CHM=_______x 10=________= 40,43 pg-------------- indica hipercromia relativa.
              rbc                    2,3
                    (hb)
CHCM= ________x 100 = 21,08 g/dl------------------indica hipocromia absoluta.
                    hto

PRÁCTICA 8:DETERMINACIÓN DEL HIERRO EN SANGRE(22-01-15)

fundamento:
Para determinar la concentración de hierro sérico (sideremia).
Determinando éste valor y comparandolo con los valores normales de sideremia se puede diagnosticar algún tipo de anemia.

fotografía de la preparación del material:

material:
-pipeta de 5ml
-micropipeta
-4 tubos de hemólisis
-agitador magnético
reactivos:
-reactivo RT preparado en clase.(R1 + R2)
-iron F2
-iron CAL
agua destilada.
muestra:
-suero.(en clase hubo equivocación y la icimos con sangre)
técnica:
-1.echamos 1ml de RT con pipeta de 5ml a los cuatro tubos .
-2.echamos una gota de R3 a todos los tubos menos al blanco muestra.
-3.echamos 0,2ml de agua destilada sólo al tubo blanco RT.
-4.echamos 0,2ml de ironCAL con micropipeta al tubo patrón.
-5.echamos 0,2ml al tubo( blanco muestra) y al tubo (muestra)

-mezclamos en agitador magnético.
-incubar al baño maría durante 5min,nosotros lo hemos dejado 10 min a temperatura ambiente.
-se introducen los cuatro tubos en el espectofotómetro y se apuntan sus absorbancias.
resultado:
-datos del aparato:
-blanco:se calibra la máquina.
-(A)patrón:0,144
-(A)blanco muestra:1,590
-(A)muestra:1,595
-realizamos la fórmula          1,595-1,590
                                         ______________x 100 = 3,47ug/dl  de hierro
                                                0,144
interpretación:
-No nos da un valor normal dentro de los valores de referencia nos da muy bajo.
-conclusión el procedimiento está bien hecho pero el resultado nos a dado inválido por la sangre utilizada no ha sido la adecuada.(nos a indicado el profesor pedro).